人类细胞分裂遵循海弗利克限度,即人的细胞分裂次数平均为50次,而端粒酶可以使细胞复制的次数远远超过海弗利克极限,故有“永生酶”之称。

,对人体创伤或衰竭的组织和器官实现人工再生与再造的一门新兴学科,它是现代临床医学的一种崭新的治疗模式,对医学治疗理论、治疗和康复方针的发展有重大的影响,也是近年来包括中国在内的世界各国政府重点发展和研究的高新科技领域之一。本文对端粒和端粒酶的组成、功能以及与再生医学的关系予以综述。

　　1　端粒、端粒酶及端粒酶催化亚单位

　　Müller和McClintock早在20世纪三四十年代就认识到端粒位于真核细胞染色体末端的重复DNA序列,是DNA与端粒酶结合蛋白构成的核蛋白复合物,其生物学功能是保护染色体不受核酸外切酶的作用,维持染色体的稳定,使之不发生降解、融合、重排和丢失等变异,而且端粒功能与基因表达有关。

　　染色体末端不完全复制导致端粒缩短是细胞衰老过程中增殖潜能逐渐丧失的原因之一。人的端粒序列为TTAGGG,端粒长度(重复次数)在不同的物种之间差异很大,从50bp到50kb,人的生殖系细胞的端粒长度约10kb。端粒相关序列最显着的特征是可变性和高度的多态性。

　　端粒酶是1985年Greider等[15]首次从四膜虫细胞提取物中发现的,是一种能延长端粒末端并保持端粒长度的核糖蛋白酶,主要成分是RNA和蛋白质,能以自身RNA为模板合成端粒DNA并加长,是一种特殊的逆转录酶。其主要功能是维持染色体的稳定,使之不发生降解、融合、重排和丢失等变异。

　　端粒酶在端粒合成中的作用主要为引物特异识别及模板作用。以自身RNA为模板特异地添加端粒DNA重复序列到染色体3′末端以加长端粒,填补复制过程中新合成链5′端留下的缺口,克服了DNA聚合酶不能从头合成线性DNA5′端留下的缺隙,从而使DNA的末端完整复制,使得端粒给染色体末端提供了一个保护性“帽子”,防止染色体相互融合、重组以及一些外切酶、连接酶及其他DNA损伤因子的作用。

　　端粒酶至少由3个亚单位组成,RNA亚单位TR、端粒酶催化亚单位TERT和端粒酶蛋白1(hu2mantelomeraseprotein1,hTP1),其中TERT是端粒酶催化功能部位,在功能上最重要并且也是现在研究最多的亚单位。端粒酶的激活是多因子参与多水平的调节过程,与其亚单位特别是TERT的表达调控有关。

　　2　端粒酶与细胞的老化和永生

　　通过对端粒末端限制性片段分析表明,细胞每次分裂后,染色体丢失50～200个端粒序列核苷酸。随着细胞分裂次数的增加,端粒长度缩短到一定临界长度时,细胞不再分裂而出现老化(M1)。故端粒的缩短被认为是正常细胞分裂和老化的分子信号。

　　如果细胞被病毒等转化,使细胞越过M1期继续分裂增殖,端粒继续缩短最终染色体出现异常形态,端粒由于太短而失去功能,则细胞发生死亡(M2)。但有少数细胞在此阶段激活了端粒酶,端粒功能得到恢复,染色体形态得以稳定,从而逃避了M2危机,越过退化而获得永生。在正常细胞恶变过程中,癌基因激活或抑癌基因失活激活了端粒酶,使染色体端粒稳定地维持在一定长度,从而使癌细胞持续增殖并获得永生。简言之,端粒酶激活是细胞走向永生的关键。端粒酶与细胞的老化和永生影响干细胞中端粒酶表达的因素包括生长因子、基因调控及其他物理化学因素。利用人端粒酶催化亚单位(humantelomerasecatalyticsubunit,hTERT)基因修饰干细胞,可有效地在体外长期扩增并维持某些干/祖细胞的多向分化潜能特性;通过异位表达hTERT使干细胞永生化,可为干细胞基础研究及临床应用提供药物筛选模型或细胞模型。

　　3　端粒酶在再生医学领域的应用

　　研究发展及现状近年来许多学者对人类端粒和端粒酶的研究表明,端粒和端粒酶调控着细胞增殖活性和细胞寿命,是决定基因扩增和稳定的主要因素。1994～1996年,有学者发现干细胞也能高水平表达端粒酶。

　　干细胞是一类具有自我复制与多向分化潜能的细胞。多种干细胞均表现出一定的端粒酶活性,端粒酶对于维持干细胞的自我复制潜能有重要意义。端粒酶活性与细胞增殖及细胞周期密切相关,它是在细胞从G0/G1期进入S期时被激活的,细胞的端粒酶活性增强;细胞寿命延长;人干细胞最为深远的潜在用途是产生细胞和组织,将其用来修复或替换丧失功能的组织和器官。由于多能干细胞经诱导可发展为特化细胞,从而可用于治疗许多疾病,包括帕金森病、脊髓损伤、脑卒中、烧伤、心脏病、糖尿病、白血病、骨关节炎和类风湿关节炎等。研究表明,hTERT修饰干细胞,有着广阔的临床应用前景,通过异位表达hTERT可以使干细胞永生化并保持其表现型,建立细胞系可用于基础研究。Ouellette等认为细胞永生化要求端粒酶活性增高,但具有端粒酶活性并不表明就可以维持端粒和永生化。另外,细胞永生化不能只单一地解释为端粒酶活性增高或端粒平均长度增长。异位表达hTERT延长细胞寿命可能与其整合的位置和端粒的水平相关,或是与端粒酶相关蛋白1在某一个细胞型所表现的特有方式有关。但仍可预计,通过异位表达hTERT于干细胞并进行体外诱导,可用于骨治疗、骨修复和新生血管形成等。目前,利用hTERT基因修饰神经干细胞或造血干细胞并进行相关研究尚未见报道。造干细胞是干细胞中开发最早、应用最广泛的细胞,如能利用hTERT基因修饰并建立起造血干细胞的细胞系,以达到体外长期扩增和维持造血干/祖细胞多向分化潜能的目的,无疑将会从一个崭新的角度,为拓展造血干/祖细胞的细胞治疗和基因治疗等研究提供足够的能长期增殖的理想靶细胞。还可定向诱导分化为成熟血细胞用于成分输血等。因此,通过异位高表达hTERT并建立起永生化的造血干/祖细胞系,可为拓展干细胞基础研究及临床应用提供药物筛选模型或细胞模型。研究显示,hTERT基因转染内皮祖细胞可使其端粒酶活性增强,此与内皮细胞血管形成特性相关。另外,还可提高细胞的有丝分裂活性、迁移活性和细胞存活力等。hTERT基因转染可增强内皮祖细胞的再生活性,将为严重局部缺血的患者提供一种新的治疗策略。Simonsen等报道,hTERT基因修饰的骨髓间质干细胞不仅能有效地体外长期扩增,而且还能维持其干/祖细胞的多向分化潜能特性。他们用包含hTERT基因的逆转录病毒载体稳定转染人骨髓间质干细胞,被转染细胞具有端粒酶活性,平均端粒长度增长,而且经历了260群体倍增水平还在继续增殖;而对照细胞在26群体倍增水平后就表现出了衰老相关的增殖阻滞。连续传代的人骨髓间质干细胞端粒酶催化亚单位仍不断产生成骨细胞标志,具有体内骨形成功能;能分化为多种细胞系,不致瘤,并且核型正常。

　　Murasawa等亦报道,异位表达hTERT的骨髓基质细胞的成骨能力增强,并稳定表达前成骨细胞标志STRO1,提示端粒酶表达有助于保持体外扩增时的成骨细胞池,还有助于克服骨髓基质细胞体外扩增时遇到的技术障碍。以上结果提示,端粒酶治疗将是骨再生和骨修复的一个有效的策略,将来还可以用来移植治疗和补充骨流失或与年龄相关的骨质疏松症。端粒酶在再生医学领域的应用研究有着广阔的前景。端粒酶可以用来使细胞复制的次数远远超过海弗利克极限,促使国际上一些高科技生物公司竞相开发端粒酶的商业潜能。1992年,美国Geron公司开始克隆端粒酶,尝试充分延长细胞的寿命,并因此延长人类的寿命。Geron公司的科学家从研究细胞老化入手,很快建立了“端粒酶平台”,他们把端粒酶遗传因子嵌入到实验室培养的人类细胞里,使这些细胞复制的次数几十次(后来上百次)地超过海弗利克极限。目前,美国科学家已培育出大量的这种细胞,这被称之为“延长人寿命的秘密”。在再生医学领域中的研究已发现端粒酶与正常皮肤的生长有一定的关系。具生理性再生能力的器官和组织如皮肤、小肠和人体大多数上皮需存在相似的细胞索来维持个体生命过程中的再生能力。Yasumoto等发现正常表皮角朊细胞有弱的端粒酶活性,可以快速黏附到有胶原Ⅳ覆盖的培养皿上的细胞亚群有高端粒酶活性,不能黏附的亚群则端粒酶活性低。

　　前者的角朊细胞富含小的增殖细胞且具有形成巨大克隆的能力。在子宫颈外口的角朊细胞和子宫颈内口的单层上皮中也获得类似的结果。Harle-Bachor等在表皮基底层细胞测得端粒酶活性,真皮层端粒酶为阴性。这些结果说明端粒酶阳性的亚群存在于正常再生的表皮细胞。

　　端粒酶可以修复端粒使细胞继续分裂下去,也许能永远不停止。因此,科学家们希望利用这种酶培养出大量的人类细胞,包括用于治疗烧伤患者的皮肤细胞、糖尿病患者需要的分泌胰岛素的细胞以及艾滋病患者需要的白细胞。研究发现,很多癌症都与端粒酶过多密切相关,端粒酶在超过80%的永生细胞系及大多数肿瘤组织中呈激活状态。端粒酶的抑制会使胚胎干细胞、骨髓造血细胞的增殖受到抑制,并使肿瘤细胞系增殖能力减弱,凋亡增加。一些研究人员担心端粒酶有可能使细胞的分裂失控,这意味着端粒酶可能引发不受约束的细胞增殖。为了研究这种可能性到底有多大,有学者在实验室里培养了人类的乳腺上皮细胞,然后使这些细胞中感染了带有端粒酶基因的病毒。正像他们所想象的那样,细胞整合了外源基因并在250次分裂后仍保持着旺盛的分裂能力,是正常细胞寿命的4倍。

　　但是在细胞生长期间,另一个基因c-myc的活力却比正常状态高2～3倍。这个基因在好几种癌中非常活跃,包括乳腺癌和某些淋巴癌。他们认为,虽然这些培养的细胞可能不是癌细胞,但他们已经朝那个方向发展,结果表明研究人员必须对细胞如何衰老有更多的了解后,才能安全利用端粒酶生长替代组织。但是Shay认为,也许癌基因被启动仅仅是由于这些细胞在实验室里的培养方式造成的。但是,作为治疗疾病的移植细胞,让细胞可以无休止地分裂的端粒酶可能不安全,因为有可能促使这种细胞转变成癌细胞。因此,该科研小组改用一种腺病毒,而不是逆转录酶病毒携带端粒酶的基因,因为腺病毒一般不会把它们的DNA并入hTEKT基因中,这就意味着hTEKT基因在分裂之前可能只有几天的活性。但是,这种方法能否使细胞寿命增加(分裂次数)还不清楚,如果能增加细胞寿命,它的用途将是巨大的。例如,可以从皮肤严重烧伤的患者身上切取皮肤细胞,然后在实验室中生长,以获得足够的皮肤用于植皮。所以对于治疗癌症而言,端粒酶是标靶,科学家力图抑制它;而对于正常干细胞而言,端粒酶又是一个“好东西”。现在科学家们的研究就是以端粒酶为基础,同时建立了两个研究体系,即以癌症治疗为目的肿瘤医学体系和以利用干细胞为手段的再生医学体系。

　　4　展　望

　　生命科学的发展方向是临床应用,对端粒和端粒酶在再生医学领域的进一步研究将会在以下几个方面得到发展及应用:①阐明端粒酶表达的调控机制;②揭示各组织器官形成过程中端粒酶表达动力学特点,为应用端粒酶激活剂再生组织器官提供理论依据;③建立特异、灵敏、准确、简便的端粒酶检测新方法;④阐明端粒酶在细胞转化—细胞永生化过程中的表达激活机制;,必须对端粒酶表达的调控的安全性和可靠性做一全面、客观、深入的评价。毋庸讳言,目前医学的发展还不能回答所有关于疾病的问题。但从系统器官再生复制发展势头和潜力来看,已为临床治疗初步打开了一条新路。开发端粒酶的商业潜能是巨大的,再生医学将成为21世纪生命科学研究领域的焦点之一,医学也将走出器官移植的范畴,步入再生组织和器官的新时代。

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